兒科

雙胞胎之大，男，2歲。因反應(yīng)差、發(fā)育遲緩8個月入院。患兒于生后27 d出現(xiàn)嘔吐、抽搐，在當?shù)蒯t(yī)院開始時疑診為敗血癥，予抗感染治療后癥狀無明顯好轉(zhuǎn)。查頭顱MRI示腦白質(zhì)密度減少，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析（GC-MS）示甲基丙二酸尿癥，予維生素B12、營養(yǎng)腦神經(jīng)等治療患兒病情有所好轉(zhuǎn)，為求進一步診治來我院。起病來，患兒吃奶、睡眠可，精神差，大小便未見明顯異常?；純合礕1P1，胎齡38＋3周，順產(chǎn)，無窒息史?；純焊改阁w健，非近親結(jié)婚。母親懷孕期間未曾服用過藥物，無放射線接觸史，家族中無類似患者。體檢：反應(yīng)差，體溫36.5℃、脈搏130次/分、呼吸24次/分、體重12 kg、身高70 cm、頭圍41cm，前囟未閉、平軟、1.5×1.5 cm，一般體檢及神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常。智力發(fā)育相當于1個月水平，動作發(fā)育相當于2個月水平。MRI示腦皮質(zhì)及腦白質(zhì)發(fā)育不良，胼胝體發(fā)育不全。血、尿常規(guī)及肝腎功能未見異常。血氨5.1mmol/L，血乳酸3.73 mmol/L，K+6.14 mmol/L，Na+151.3 mmol/L，CO2CP14 mmol/L，CK-MB30.9 U/L，陰離子間隙（GA）36 mmol/L， GC-MS分析示尿液中甲基丙二酸838.1 mg/g 肌苷(正常值0.2～3.6 mg/g 肌苷)和甲基枸櫞酸615.8 mg/g 肌苷(正常值4.5 mg/g 肌苷)明顯增高，分別為正常值的559倍和154倍。尿液中同型半胱氨酸24.9 mmol/L (正常對照<5.0 mmol/L)，血漿同型半胱氨酸98.37 mmol/L (正常對照4.45～12.42 mmol/L)，串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）檢查未見明顯異常，MMACHC基因中第4外顯子609G—>A。診斷為甲基丙二酸尿癥合并同型半胱氨酸血癥（cblC型）。予以VitB12 1 mg/d肌注，特殊治療奶粉（XMTVI Analog，為不含蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸，含少量異亮氨酸的配方奶粉）100ml/（kg·d），甲鈷銨片1 mg/d，左旋肉堿160 mg/d。上述治療效果顯著，符合甲基丙二酸尿癥VitB12有效型。確診后回家用特殊奶粉喂養(yǎng)，肌注VitB12 1mg，每月1次，并添加葉酸5 mg/d和甜菜堿1000 mg/d，跟蹤隨訪患兒12個月，患兒甲基丙二酸和同型半胱氨酸已降至3.7mg/g 肌苷和60 mmol/L，會坐和站，扶持下可行走，會說簡單的字、詞。雙胞胎之小，男，2歲。因反應(yīng)差、發(fā)育遲緩8個月入院?；純河谏?3 d出現(xiàn)嘔吐、抽搐。病情﹑體檢﹑實驗室檢查﹑診斷和治療情況與哥哥基本類似。討論：甲基丙二酸尿癥為常染色體隱性遺傳病。發(fā)病率1/50 000～1/80 000[1]，根據(jù)酶缺陷的類型分為甲基丙二酰輔酶A變位酶（mut）缺陷及其輔酶鈷銨素（VitB12）代謝障礙二大類, 鈷銨素中CblC、CblD、CblF型患者生化特點為甲基丙二酸尿癥合并同型半胱氨酸血癥, 通過對該家系常見突變基因分析此雙胞胎MMACHC基因中第4外顯子609G—>A，即MMACHC基因609位的4號外顯子由鳥嘌呤(guanine G)突變?yōu)橄汆堰?adenine A), 導(dǎo)致編碼色氨酸的密碼子UGG變成了終止密碼子UGA。翻譯成的蛋白質(zhì)將不完整，功能也隨之降低。此基因突變結(jié)果表明該雙胞胎均為CblC型甲基丙二酸尿癥患兒。目前國外已有12例該突變位點的報道，其中5例為東亞患兒[2]，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)具體分型和基因突變分析的報道。根據(jù)對VitB12治療的反應(yīng)還可分為VitB12治療有效型和VitB12治療無效型兩種。甲基丙二酸尿癥合并同型半胱氨酸血癥的患兒的病死率高達29.5％，早期發(fā)現(xiàn)和治療顯的尤為重要[3]。該病患兒可有嘔吐、嗜睡、驚厥、運動智力發(fā)育落后等癥狀，有代酸、血氨、血乳酸和GA增高等表現(xiàn)以及頭顱影像學(xué)的改變，但臨床特異性不強，容易漏診和誤診，GC-MS法對高?；純哼M行篩查可使此類患兒得到早期診斷。該雙胞胎在急性期的治療以補液、糾正酸中毒為主；用大劑量VitB12試驗治療,1mg/d 肌肉注射,3~5 d 后對照治療前后尿甲基丙二酸濃度,判斷對VitB12的反應(yīng)性。該雙胞胎患兒為VitB12有效型，其維生素B12長期維持劑量為每周至每月肌注1mg，逐步穩(wěn)定后改服用甲基鈷銨素500～1000μg/d；注意限制天然蛋白質(zhì),補充特殊配方奶粉；左旋肉堿可促進脂酰肉堿排泄，急性期采用靜脈或肌內(nèi)注射肉堿每日100~200 mg/kg，緩解期30~60 mg/kg。由于該雙胞胎患兒合并同型半胱氨酸血癥,還給予甜菜堿補充治療(1000~ 3000 mg/d)，葉酸5 mg/d。通過康復(fù)治療糾正和改善運動智力發(fā)育落后。 [1，4]。通過胎盤絨毛細胞，羊水細胞酶學(xué)檢查，母親尿及羊水甲基丙二酸測定,可進行本癥的產(chǎn)前診斷，國內(nèi)外取得了成功的經(jīng)驗，值得借鑒[5]。參考文獻［1］ Horster F, Hoffmann GF. Pathophysiology, diagnosis, and treatment of methylmalonic aciduria-recent advances and new challenges. Pediatr Nephrol, 2004, 19:1071-1074.(期刊)［2］ Lerner-Ellis JP, Tirone JC, Pawelek PD, et al. Identification of the gene responsible for methylmalonic aciduria and homocystinuria, cblC type. Nat Genet,2006,38:93-100.(期刊)［3］ Rosenblatt DS, Aspler AL, Shevell MI, et al. Clinical heterogeneity and prognosis in combined methylmalonic aciduria and homocystinuria (CblC). J Inherit Metab Dis, 1997, 20:528-538.(期刊)［4］ 侯新琳,錢寧,楊艷玲.甲基丙二酸尿癥研究進展,中國當代兒科雜志, 2005, 7:183-185.(期刊)［5］ Morel CF, Wstkins D, Scott P, et al. Prenatal diagnosis for methylmalonic acidemia and inborn errors of vitamin B12 metabolism and transport. Mol Genet Metab, 2005, 86(1-2):160-171.(期刊)

遺傳性代謝?。╥nherited metabolic disorders, IMD）又稱先天性代謝缺陷（inborn errors of metabolism，IEM），是由于參與體內(nèi)代謝的某種酶、運載蛋白、膜或受體等的編碼基因發(fā)生突變，從而導(dǎo)致機體生化代謝紊亂，造成中間、旁路代謝產(chǎn)物蓄積，或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組疾病[1，2]。IMD 多為常染色體隱性遺傳，少數(shù)為常染色體顯性遺傳、X/Y連鎖伴性遺傳及線粒體遺傳等。IMD單一病種發(fā)病率低, 屬少見病或罕見病, 但其病種多樣（迄今已發(fā)現(xiàn)的IMD超過1000種），故總體發(fā)病率并不低[1-3]。按發(fā)生異常的生化物質(zhì)不同，IMD主要分為有機酸、氨基酸、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和尿素等先天性代謝缺陷[1] (表1)。表1 主要IMD的生化分類生化分類主要IMD有機酸代謝病氨基酸代謝病碳水化合物代謝病蛋白質(zhì)代謝病尿素循環(huán)障礙脂質(zhì)代謝病線粒體病溶酶體貯積病過氧化小體病其他甲基丙二酸血癥、丙酸血癥、異戊酸血癥、戊二酸血癥苯丙酮尿癥、非酮癥性高甘氨酸血癥、遺傳性酪氨酸血癥、同型半胱氨酸尿癥、楓糖尿癥、維生素B6依賴癥半乳糖血癥、糖原累積癥、遺傳性果糖不耐受癥、磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶缺陷癥家族性高脂蛋白血癥、無白蛋白血癥、轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、氨甲酰磷酸合成酶缺陷癥、精氨酸酶缺陷癥、瓜氨酸血癥、精氨酸琥珀酸血癥戈謝氏病、尼曼-匹克氏病、Faber病脂肪酸氧化障礙：肉堿循環(huán)缺陷癥、短/中/長鏈乙酰CoA脫氫酶缺陷癥；能量代謝障礙：丙酮酸脫氫酶缺陷癥、丙酮酸羧化酶缺陷癥、Leigh病、線粒體腦肌病粘多糖病、GM-1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病、甘露糖沉積癥、巖藻糖沉積癥、Wolman病、Krabbe病腦肝腎綜合征、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良先天性甲狀腺功能低下癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、Citrin綜合征、Crigler-Najjar綜合癥、肝豆狀核變性、Menkes 病、遺傳性乳清酸尿癥、胰腺囊性纖維性性變IMD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，隨年齡、性別不同而有差異。半數(shù)以上在新生兒出生后數(shù)小時或幾天內(nèi)即發(fā)??；部分在幼兒期、兒童期、青少年期甚至成年期發(fā)病。IMD發(fā)病年齡越早，病情越重，死亡率越高，是不明原因危重患兒死亡的重要原因之一，存活者可造成永久性嚴重損害, 如智力低下、 運動發(fā)育遲緩等[1]。必須強調(diào)的是，IMD并非均為不治之癥，早期治療對患兒預(yù)后意義重大，許多IMD及時采取干預(yù)措施可以明顯改善預(yù)后，部分IMD甚至可以經(jīng)針對性措施治療得以臨床治愈[1-4]。早期干預(yù)有賴于正確的早期診斷。由于IMD病種數(shù)量繁多、發(fā)病機理復(fù)雜，且其臨床表現(xiàn)具有多樣性和缺乏特異性，一般傳統(tǒng)輔助檢查手段不能提供確診依據(jù)，臨床醫(yī)生往往難以作出具體病因診斷，臨床確診大多依賴于患兒體液（血、尿等）中特異性異常代謝物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，或者進行酶學(xué)和基因分析。傳統(tǒng)的IMD 篩查方法(如Guthrie細菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗等) 都屬于“一種實驗檢測一種疾病”,所花費用高、周期長，不適用于多種疾病的群體篩查[1，3，5]。1966年，Tanaka采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）檢測到異戊酸血癥，為IMD的生化診斷指明了新方向；以后隨著技術(shù)的不斷改進，許多有機酸代謝病因應(yīng)用GC-MS而得到確診；進入20世紀，Millington 等[6]首次將串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS-MS）用于新生兒IMD篩查，Shoemaker和Matsumoto等[7，8]建立了分析尿代謝產(chǎn)物的尿素酶預(yù)處理-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(Urease pretreatment-Gas Chromatography-Mass Spectrometry, UP-GC-MS)，為IMD的篩查和生化診斷開啟了新紀元；在此后的20 年的時間里，MS-MS和GC-MS已經(jīng)發(fā)展成為 IMD 篩查中最理想、最成熟、最精確、最特異的分析技術(shù)，真正實現(xiàn)了從“一種實驗檢測一種疾病到一種實驗檢測多種疾病”的轉(zhuǎn)變, 并且使檢測假陽性和假陰性的發(fā)生率明顯降低[9-11]。一般認為，IDM的診斷應(yīng)采取新生兒及高?；純汉Y查相結(jié)合的方式進行，包括MS-MS和GC-MS在內(nèi)的質(zhì)譜技術(shù)是公認的IMD篩查技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)是根據(jù)樣品離子的質(zhì)量電荷比來進行定性和定量研究的一種分析技術(shù)，其中MS-MS主要用于血液代謝組分分析，而GC-MS主要用于尿液代謝產(chǎn)物分析，它們的價值在于能夠在無癥狀或癥狀前期發(fā)現(xiàn)IMD，使IMD早期干預(yù)成為可能。MS-MS和GC-MS技術(shù)具有如下特點：①極高的分析效率和廣泛的篩查范圍，能在較短時間內(nèi)完成檢測分析出血、尿等體液200余種代謝物，診斷出超過100余種遺傳代謝?。虎趯w內(nèi)生化物質(zhì)進行精確無誤的分析，特異性、敏感性和可重復(fù)性高；③具備充裕的采樣時間，嬰兒出生后即可開始采樣[12-16]。目前，北美、歐洲、日本和新加坡等發(fā)達國家已將普遍將MS-MS和GC-MS技術(shù)應(yīng)用于小兒遺傳代謝病篩查方案中[ 17-20]，而我國普遍采用的Guthrie細菌抑制法進行新生兒IMD的診斷，只能檢測2~4種疾病，法定篩查項目為2種疾病，并且人口覆蓋率不足20％。近五年來，我國加大了對新生兒和高危兒篩查項目的推進力度，先后出臺了一系列的法律法規(guī)，各級政府也在此方面投入了大量的經(jīng)費，北京、上海、廣州、浙江、武漢等地區(qū)已經(jīng)開始建立基于質(zhì)譜技術(shù)的IMD篩查實驗室，對新生兒及高危兒進行IMD篩查、診斷和治療研究[21-32]。一、MS-MS技術(shù)及其檢測的IMD所謂MS-MS技術(shù)就是將二個質(zhì)譜儀經(jīng)一個碰撞室串聯(lián)而成，目的是提高檢測的特異性和靈敏性。測定樣品時，樣品首先在離子源中被離子化，隨即通過第一級質(zhì)譜(MS1) 選擇一定質(zhì)荷比的離子使其進入碰撞室, 與室內(nèi)的碰撞氣(常用的氣體為He、Ar、N2等) 進行碰撞誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生碎片離子, 再由第二級質(zhì)譜( MS2)根據(jù)質(zhì)荷比對碎片離子進行選擇分析，故MS-MS是一種高靈敏度、高特異性的快速分析技術(shù)[12]。近年來MS-MS技術(shù)發(fā)展較快，能在 2~3分鐘內(nèi)對一個標本（只需數(shù)滴血）進行幾十種代謝產(chǎn)物分析，可篩查出包括氨基酸、有機酸代謝紊亂、尿素循環(huán)障礙和脂肪酸氧化缺陷等在內(nèi)的40余種IMD；該方法還可同時自動計算相關(guān)物質(zhì)的比值，兩者結(jié)合明顯降低假陽性和假陰性的發(fā)生率，提高對某些疾病診斷的準確性[15，16，20]。例如某血樣通過MS-MS分析（AA和AC掃描模式），發(fā)現(xiàn)亮氨酸（Leu）、異亮氨酸(Ile) 和纈氨酸(Val)等支鏈氨基酸水平明顯升高，且Leu/Ile比值也超過正常范圍12倍，提示楓糖尿癥存在（圖1）。值得注意的是，MS-MS篩查的敏感性很大程度依賴于臨界值的選擇,并且不能區(qū)分同分異構(gòu)體，因此對于有些IMD仍需進行 GC-MS、酶學(xué)和DNA突變等分析來確定。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳科學(xué)院頒布的新生兒篩查指南[33],在54 種需要篩查的 IMD 疾病中, 有38種可以采用串聯(lián)質(zhì)譜方法分析,所涉及的IMD 疾病種類包括氨基酸代謝紊亂,有機酸癥, 脂肪酸氧化缺陷(?；舛緣A缺乏)和尿素循環(huán)缺陷等。圖1 MS-MS分析掃描圖（AA和AC模式）一、GC-MS技術(shù)及其檢測的IMD在GC-MS中，GC的主要作用是將尿液中混合物分離，得到單一組分；質(zhì)譜則對單一組分的結(jié)構(gòu)和含量逐一定性、定量分析，得到的各種成分的峰共同構(gòu)成了尿液標本的總離子流圖（圖2）。GC-MS儀的軟件分析系統(tǒng)根據(jù)所測物質(zhì)出峰時間、峰面積積分和特征離子，精確識別物質(zhì)及其含量[7，11]（圖3）。由于人體尿液中含有較多的尿素，明顯影響其他微量物質(zhì)的測定，必須予以去除。利用尿素酶預(yù)先分解尿液中的尿素，然后進行GC-MS測定（即UP-GC-MS技術(shù)）完全能達到這一要求。UP-GC-MS通過分析尿液中代謝物的信息，可以實現(xiàn)一次進樣同時檢測氨基酸、有機酸、單糖、二糖、糖醇、卟啉、嘧啶和核酸類等250余種代謝產(chǎn)物[7，15，16]，結(jié)合臨床，可對120余種IMD作出診斷。尿液 GC-MS分析對 IMD篩查有其優(yōu)勢，除標本易收集、檢測IMD病種范圍廣外，GC-MS是某些有機酸代謝病的確診方法。這是因為具有揮發(fā)性的有機酸血漿水平不穩(wěn)定，應(yīng)用MS-MS測定可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但應(yīng)用GC-MS檢測其尿中代謝產(chǎn)物可以間接反映其前體物質(zhì)（揮發(fā)性酸）的水平。GC-MS用于IMD篩查不足之處在于標本處理成本高,分析時間偏長,不適合大規(guī)模常規(guī)篩查；某些代謝病的異常產(chǎn)物不經(jīng)尿液排泄或此法不能檢測（如?；舛緣A）,這些物質(zhì)不能單獨由 GC-MS的方法檢出,而必須配合其他方法[15，16]。圖2 UP-GC-MS尿代謝產(chǎn)物測定總離子流圖及其分析結(jié)果（甲基丙二酸、甲基枸櫞酸等有機酸特異性升高，提示甲基丙二酸尿癥）圖3 尿特異性代謝產(chǎn)物甲基丙二酸（MMA）、甲基枸櫞酸（Me-citrate）的提取離子圖（MMA出峰時間為7:17，特征離子是218、247；Me-citrate出峰時間為11:58，特征離子是287、479。最終結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸比正常范圍增高1011倍，甲基枸櫞酸比正常范圍增高17倍）。應(yīng)用MS-MS和GC-MS技術(shù)進行篩查和診斷IMD時應(yīng)該注意：①色譜儀和質(zhì)譜儀是一種復(fù)雜昂貴的分析儀器，對掌握儀器的技術(shù)和質(zhì)量控制要求較高，且IMD的發(fā)生牽涉到復(fù)雜的生化反應(yīng)，分析結(jié)果的解釋也較復(fù)雜，要求技術(shù)人員和臨床醫(yī)師具有較高的專業(yè)素質(zhì)；②在IMD篩查和診斷過程中，要選擇適當?shù)臋z測方法。這是因為MS-MS和GC-MS具有各自的檢測范圍，僅存在部分交叉，故兩種檢測方法不能完全替代，即有些IMD適合MS-MS檢測，有些IMD需要進行GC-MS分析，還有一些IMD同時進行MS-MS和GC-MS測定才能診斷。③MS-MS和GC-MS檢測結(jié)果可為 IMD診斷提供有價值的線索，但部分疾病的確診往往要結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢查結(jié)果進行綜合分析才能做出。④某些代謝病在發(fā)作間歇期代謝異常不明顯，飲食或藥物可干擾 GC-MS結(jié)果，因此一次MS-MS和/或 GC-MS檢查有時不能確定或排除 IMD，應(yīng)在必要時復(fù)查。⑤應(yīng)用用MS-MS和/或GC-MS 進行新生兒疾病篩查時，不僅需要政策上的支持，還要考慮實施的可行性、社會效益和成本效益[12，22，34]?？傊?，質(zhì)譜技術(shù)在IMD檢測方面具有廣闊的前途，MS-MS和GC-MS技術(shù)已經(jīng)成為小兒IMD篩查和診斷的主要技術(shù)，歐、美、日本等發(fā)達國家已將其作為新生兒及高危兒IMD常規(guī)篩查和診斷方法；在國內(nèi)，北京、上海、廣州及武漢等一線城市也已應(yīng)用MS-MS和GC-MS檢測小兒IMD，取得了一定的成效，但總體仍處在起步階段，相信在不遠的將來，隨著我國MS-MS和GC-MS技術(shù)的不斷發(fā)展和人才隊伍的建立，我國小兒IMD篩查和診斷水平將會有一個突破性提高。參考文獻1. 邵肖梅，葉鴻瑁，丘小汕. 實用新生兒學(xué). 北京:人民衛(wèi)生出版社,第4版,2011:816-840.2. 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